WSTĘP 

W Polsce zapadalność na zawał serca, który jest główną przyczyną śmiertelności na świecie, szacuje się na około 30 000 przypadków rocznie [1]. Wyniki dotychczasowych badań wskazują, że ostremu niedokrwieniu mięśnia sercowego towarzyszą zaburzenia funkcjonowania układu odpornościowego dotyczące programowanej śmierci komórki, czyli apoptozy [2, 3]. W prawidłowych tętnicach indeks apoptotyczny i mitotyczny komórek jest mały, zmienia się natomiast w stanach patologicznych, a zaburzenia równowagi między proliferacją i apoptozą mogą sprzyjać progresji zmian chorobowych [4]. Pomimo, że w zawałowym miokardium oba rodzaje śmierci komórki prowadzą do śmierci kardiomiocytów, to zwłaszcza udział apoptozy daje potencjalne możliwości regulacji tego zjawiska [5].

Jednym z lepiej poznanych białek biorących udział w indukcji apoptozy jest czynnik martwicy nowotworu TNF (ang. tumor necrosis factor), który wytwarzany jest przez monocyty i makrofagi, niedokrwione kardiomiocyty oraz gromadzące się w strefie niedokrwienia makrofagi i granulocyty obojętnochłonne [6]. Cytokina ta także jest wiązana z rozwojem kardiomiopatii rozstrzeniowej, zmniejsza przepływ krwi przez mięśnie szkieletowe, pogłębia dysfunkcję śródbłonka naczyń krwionośnych oraz indukuje apoptozę kardiomiocytów i komórek śródbłonka, co może wpływać na wielkość obszaru miokardium objętego zawałem [7]. TNF wywiera efekt biologiczny poprzez swoiste receptory, w tym występujące w płynach ustrojowych rozpuszczalne receptory: sTNF-R1 (ang. soluble tumor necrosis factor receptor type 1) i sTNF-R2 (ang. soluble tumor necrosis factor receptor type 2). Oba rozpuszczalne receptory utrzymują zdolność do wiązania się z ligandem, jak również zdolność do hamowania cytotoksycznego wpływu TNF na komórki. Ich stężenie koreluje ze stopniem aktywacji układu TNF/TNF-receptor komórkowy [8]. Dotychczasowe wyniki badań zwracają uwagę na fakt, że rozpuszczalne receptory mogą odgrywać ważną rolę w modulacji odpowiedzi immunologicznej poprzez udział w wiązaniu i inaktywacji TNF, prowadząc tym samym do inaktywacji apoptozy [9]. 

Z uwagi na rolę, jaką pełni układ TNF/TNF-R w regulacji odpowiedzi immunologicznej celem pracy była ocena dynamiki zmian stężenia czynnika martwicy nowotworu (TNF) oraz rozpuszczalnych receptorów dla TNF: typu 1 (sTNF-R1) i typu 2 (sTNF-R2) w surowicy krwi pacjentów z zawałem serca z uniesieniem odcinka ST. 

MATERIAŁ I METODY 

Grupę badaną stanowiło 70 pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST w wieku od 42 do 75 lat (średnia wieku: 58,3±7,6 lat). Wśród chorych było 40 mężczyzn w wieku od 53 do 66 lat (średnia wieku: 56,3±4,0 lat) oraz 30 kobiet w wieku od 42 do 75 lat (średnia wieku: 57,9±10,3 lat). U pacjentów rozpoznano pierwszy w życiu zawał mięśnia sercowego na podstawie objawów klinicznych, nieprawidłowości w zapisie elektrokardiograficznym (EKG), zwiększonych wartości markerów martwicy mięśnia sercowego i zaburzeń kurczliwości w badaniach obrazowych. 

Krew od każdego pacjenta pobierano w czterech okresach: I. – w dniu przyjęcia, II. – po 12 godzinach, III. – po 24 godzinach, IV. – w 5 dobie. Materiałem wykorzystanym do badań była surowica krwi. Od każdego pacjenta pobierano 5 ml krwi z żyły łokciowej na skrzep. Po oddzieleniu powstałego skrzepu, krew wirowano z szybkością 2000 x g przez 10-15 minut. Tak otrzymaną surowicę zamrożono w temperaturze -22°C do czasu wykonania badań. 

Do oznaczenia stężenia TNF, sTNF-R1 i sTNF-R2 zastosowano metodę immunoenzymatyczną ELISA. W tym celu wykorzystano następujące zestawy: human TNF-a, human sTNF-R (60kDa) i human sTNF-R (80kDa) ELISA firmy Bender Medsystems Diagnostics GmbH, Wiedeń, Austria. Czułość testów wynosiła: TNF – 5,8 pg/ml, sTNF-R1 – 0,08 ng/ml i sTNF-R2 – 0,15 ng/ml. Wszystkie badane osoby wyraziły zgodę na przeprowadzenie badań. Uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. 

Wyniki poddano analizie statystycznej, korzystając z programu komputerowego Statistica for Windows wersja 8.0 oraz Microsoft Excel. W celu zweryfikowania rozkładu otrzymanych wyników zastosowano test Shapiro-Wilka. Po ustaleniu, że uzyskane wyniki odpowiadały rozkładowi normalnemu, dla każdego parametru obliczono średnią arytmetyczną (–x) i odchylenie standardowe (SD). Średnie wartości badanego parametru porównywano za pomocą testu t-Studenta. Za istotny statystycznie przyjmowano poziom p<0,05. 

WYNIKI 

Uzyskane wyniki zilustrowano na rycinach 1 i 2. W dniu przyjęcia stężenie TNF w surowicy badanych było największe i wahało się od 30,02 do 42,07 pg/ml (średnia 37,66±2,62 pg/ml). 

Po 12 godzinach stężenie badanego parametru wynosiło od 24,53 do 29,63 pg/ml (średnia 27,23±1,71 pg/ml) i było istotnie obniżone w porównaniu ze stężeniem stwierdzonym w dniu przyjęcia (p<0,01). Po 24 godzinach od przyjęcia stężenie TNF obejmowało zakres od 20,02 do 26,44 pg/ml (średnia 23,24±1,91 pg/ml) i bardzo istotnie malało w porównaniu ze stężeniem oznaczanym po 12 godzinach (p<0,0001). W 5 dobie stężenie TNF mieściło się w zakresie od 11,58 do 18,01 pg/ml (średnia 13,51±1,28 pg/ml) i istotnie malało w porównaniu ze stężeniem oznaczonym po 24 godzinach (p<0,0001). 

W dniu przyjęcia stężenie sTNF-R1 było największe i wahało się od 1,74 do 2,81 ng/ml (średnia 2,43±0,33 ng/ml). Po 12 godzinach stężenie badanego parametru wynosiło od 1,09 do 2,64 ng/ml (średnia 1,94±0,46 ng/ml) i było bardzo istotnie obniżone w porównaniu ze stężeniem stwierdzonym w dniu przyjęcia (p<0,0001). Po 24 godzinach od przyjęcia stężenie sTNF-R1 obejmowało zakres od 0,80 do 2,22 ng/ml (średnia 1,45±0,42 ng/ml) i bardzo istotnie malało w porównaniu ze stężeniem oznaczanym po 12 godzinach (p<0,0001). W 5 dobie stężenie sTNF-R1 mieściło się w zakresie od 0,56 do 1,97 ng/ml (średnia 0,99±0,37 ng/ml) i istotnie malało w porównaniu ze stężeniem oznaczonym po 24 godzinach (p<0,0001). 

W dniu przyjęcia stężenie sTNF-R2 także było największe i wahało się od 0,20 do 0,88 ng/ml (średnia 0,52±0,21 ng/ml). Po 12 godzinach stężenie badanego parametru wynosiło od 0,18 do 0,57 ng/ml (średnia 0,40±0,13 ng/ml) i było istotnie obniżone w porównaniu ze stężeniem stwierdzonym w dniu przyjęcia (p<0,01). Po 24 godzinach od przyjęcia stężenie sTNF-R2 obejmowało zakres od 0,14 do 0,55 ng/ml (średnia 0,29±0,11 ng/ml) i bardzo istotnie malało w porównaniu ze stężeniem oznaczanym po 12 godzinach (p<0,0001). W 5 dobie stężenie sTNF-R2 mieściło się w zakresie od 0,12 do 0,40 ng/ml (średnia 0,24±0,09 ng/ml) i malało w porównaniu ze stężeniem oznaczonym po 24 godzinach, ale różnice nie były istotne statystycznie. Analiza uzyskanych wyników nie wykazała różnic istotnych statystycznie pomiędzy stężeniem TNF, sTNF-R1 i sTNF-R2 a płcią badanych pacjentów. 

DYSKUSJA 

Dotychczasowe badania wskazują na znaczenie programowanej śmierci komórek w patogenezie chorób układu krążenia, zwłaszcza w zawale mięśnia sercowego [3]. Wyjaśnienie molekularnych mechanizmów, które regulują ten proces, może okazać się pomocne w opracowaniu nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych tych chorób. Uwagę zwracają badania nad możliwościami regulacji szlaków apoptozy poprzez jeden z najważniejszych układów TNF – TNF-R oraz ich form rozpuszczalnych. 

Z przeprowadzonych przez nas badań wynika, że u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST w dniu przyjęcia do szpitala zaobserwowano wysokie stężenie TNF. Stężenie tego parametru istotnie malało w kolejnych dniach, co wskazuje na znaczący udział tej cytokiny w przebiegu ostrego niedokrwienia mięśnia serca. Podobne wyniki otrzymali Di Stefano i wsp. [10]. Stwierdzili oni, że stężenie TNF i sTNF-R1 wykazuje znaczny spadek w kolejnych terminach badania: po tygodniu i miesiącu. Ponadto, stężenie TNF nie różniło się istotnie statystycznie pomiędzy pacjentami z zawałem z uniesieniem odcinka ST i bez. Z kolei Kosmala i wsp. [11, 12] stwierdzili istotny statystycznie wzrost stężenia TNF w surowicy chorych ze świeżym zawałem serca oraz chorobą wieńcową w porównaniu do grupy kontrolnej. Autorzy oznaczali stężenie TNF w 2, 10 i 30 dniu od rozpoczęcia leczenia trombolitycznego, co pozwalało prześledzić dynamikę zmian stężeń w surowicy w zależności od odwracalności dysfunkcji skurczowej. Stężenie TNF 

w kolejnych terminach badania istotnie malało. Szybszy spadek stężenia TNF obserwowano u pacjentów z utrzymującym się polepszeniem stanu zdrowia w porównaniu z chorymi, u których stwierdzono obecność nieodwracalnych zaburzeń kurczliwości mięśnia serca czy niekorzystnych następstw, takich jak: śmierć sercowa lub powtórny zawał. Zdaniem Lin’a i wsp. [13] oznaczanie stężenia TNF u chorych po przebytym zawale może okazać się przydatnym markerem diagnostycznym i prognostycznym, który pozwala na ocenę stopnia uszkodzenia mięśnia sercowego. 

Safronow i wsp. [14] oznaczali stężenie TNF i jego receptorów w osoczu pacjentów z chorobą wieńcową. Grupę badaną tworzyli chorzy z przebytym zawałem, niewydolnością serca i z zespołem metabolicznym. U chorych z niewydolnością serca obserwowano znacznie wyższe stężenie TNF, sTNF-R1 i sTNF-R2 w porównaniu do chorych z przebytym zawałem serca, niedotlenieniem lub zespołem metabolicznym. Zdaniem autorów współwystępująca astma lub przewlekła obturacyjna choroba płuc również miały wpływ na wzrost stężenia oznaczanych parametrów. Zwraca uwagę silna, dodatnia korelacja stężenia TNF ze stężeniem swoistych receptorów, co zdaniem badaczy odzwierciedla zaburzenie czynności serca i nerek u pacjentów z niedokrwienną chorobą serca, a nie jest odzwierciedleniem rozległości zmian w tętnicach wieńcowych. 

Mizia-Stec i wsp. [15, 16, 17] badali analizowane parametry u chorych z niestabilną i stabilną chorobą wieńcową. Zaobserwowali oni znaczący wzrost stężenia TNF i jego rozpuszczalnych receptorów w surowicy osób z chorobą wieńcową, który korelował z zaburzeniami gospodarki lipidowej. Ponadto, stwierdzili także wyższe stężenie TNF u chorych z zawałem serca w porównaniu do chorych z niestabilną dusznicą. Natomiast wyższe stężenie sTNF-R1 u chorych ze stabilną chorobą wieńcową tłumaczyli mechanizmem kompensacyjnym przewlekłego procesu miażdżycowego. Również ci sami autorzy oznaczyli stężenie TNF i sTNF-R1 u 70 pacjentów z chorobą wieńcową w trakcie terapii [15]. Stwierdzili oni, że po 2-letnim okresie standardowego leczenia stężenie badanych parametrów istotnie statystycznie zmniejszyło się w porównaniu do stanu wyjściowego, choć w obu przypadkach było wyższe w porównaniu do kontroli. Zmniejszenie stężenia TNF i sTNF-R1 może sugerować, że efektywna terapia choroby wieńcowej powinna być związana ze zmniejszeniem aktywności markerów stanu zapalnego. Podobnie, w badaniach prowadzonych przez Straburzyńską i wsp. [18] zaobserwowano wzrost stężenia sTNF-R1 i sTNF-R2 u pacjentów z przewlekłą niewydolnością serca w porównaniu z grupą kontrolną. Autorzy wykazali negatywną korelację pomiędzy stężeniem rozpuszczalnych receptorów dla TNF a parametrami zmienności rytmu zatokowego. 

Obecnie trwają badania nad zastosowaniem czynników regulujących proces apoptozy w leczeniu zawału. Uważa się, że zahamowanie procesów apoptozy w mięśniu sercowym podczas zawału może być nowym celem terapeutycznym ograniczającym rozmiar zmian i dysfunkcji mięśnia sercowego. Dodatkowo, zablokowanie procesów apoptozy na drodze TNF – TNF-R może stanowić jedną z możliwych strategii w leczeniu stanów pozawałowych [19, 20]. 

WNIOSKI 

W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że u pacjentów z zawałem serca obserwuje się nasilenie procesu apoptozy, co manifestuje się wzrostem stężenia TNF, sTNF-R1 i sTNF-R2. Pomiar stężenia badanych parametrów może okazać się pomocny w monitorowaniu przebiegu zawału mięśnia  sercowego, co wymaga dalszych badań. 

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1. Sadowski M, Gąsior M, Gierlotka M, Janion M, Poloński L: Charakterystyka kliniczna polskich kobiet z zawałem serca z uniesieniem odcinka ST. Kardiologia Polska 2010; 68: 627-634. 

2. McCully JD, Wakiyama H, Hsieh YJ, Jones M, Levitsky S: Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 286: H1923-1935. 

3. Whelan RS, Kaplinskiy V, Kitsis RN: Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol 2010; 72: 19-44. 

4. McCarthy NJ, Bennett MR: The regulation of vascular smooth muscle cell apoptosis. Cardiovasc Res 2000; 45: 747-755. 

5. Mani K: Programmed cell death in cardiac myocytes: strategies to maximize post-ischemic salvage. Heart Fail Rev 2008; 13: 193-209. 

6. Katare RG, Ando M, Kakinuma Y, Arikawa M, Yamasaki F, Sato T: Differential regulation of TNF receptors by vagal nerve stimulation protects heart against acute ischemic injury. J Mol Cell Cardiol 2010; 49: 234-244. 

7. Olofsson PS, Söderström LA, Jern C i wsp.: Genetic variants of TNFSF4 and risk for carotid artery disease and stroke. J Mol Med 2009; 87: 337-346. 

8. Croft M: The role of TNF superfamily members in T-cell function and diseases. Nat Rev Immunol 2009; 9: 271-285. 

9. Esposito E, Cuzzocrea S: TNF-alpha as a therapeutic target in inflammatory diseases, ischemia-reperfusion injury and trauma. Curr Med Chem 2009; 16: 3152-3167. 

10. Di Stefano R, Di Bello V, Barsotti MC i wsp.: Inflammatory markers and cardiac function in acute coronary syndrome: difference in ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI) and in non-STEMI models. Biomed Pharmacother 2009; 63: 773-780. 

11. Kosmala W, Derzhko R, Przewlocka-Kosmala M, Orda A, Mazurek W: Plasma levels of TNF-alpha, IL-6, and IL-10 and their relationship with left ventricular diastolic function in patients with stable angina pectoris and preserved left ventricular systolic performance. Coron Artery Dis 2008; 19: 375-382. 

12. Kosmala W, Przewlocka-Kosmala M, Mazurek W: Proinflammatory cytokines and myocardial viability in patients after acute myocardial infarction. Int J Cardiol 2005; 8, 101: 449-456. 

13. Lin XM, Zhang ZY, Wang LF i wsp.: Attenuation of tumor necrosis factor-alpha elevation and improved heart function by postconditioning for 60 seconds in patients with acute myocardial infarction. Chin Med J (Engl) 2010; 123: 1833-1839. 

14. Safranow K, Dziedziejko V, Rzeuski R i wsp.: Plasma concentrations of TNF-alpha and its soluble receptors sTNFR1 and sTNFR2 in patients with coronary artery disease. Tissue Antigens 2009; 74: 386-392. 

15. Mizia-Stec K, Gąsior Z, Zahorska-Markiewicz B, Holecki M, Kumor P: Heart Vessels. Inflammatory markers in a 2-year follow-up of coronary artery disease. Heart Vessels 2006; 21: 302-308. 

16. Mizia-Stec K, Gąsior Z, Zahorska-Markiewicz B, Janowska J, Szulc A, Jastrzębska-Maj E, Kobielusz-Gembala I: Serum tumour necrosis factor-alpha, interleukin-2 and interleukin-10 activation in stable angina and acute coronary syndromes. Coron Artery Dis 2003; 14: 431-438. 

17. Mizia-Stec K, Mandecki T, Zahorska-Markiewicz B, Janowska J, Szulc A, Jastrzębska-Maj E, Szymański L: Tumor necrosis factor alpha and its soluble receptors in serum of patients with coronary artery disease. Pol Merkur Lekarski 2001; 11: 19-25. 

18. Straburzyńska-Migaj E, Ochotny R, Wachowiak-Baszyńska A i wsp.: Cytokines and heart rate variability in patients with chronic heart failure. Kardiol Pol 2005; 63: 478-485. 

19. Shaw SM, Shah MK, Williams SG, Fildes JE: Immunological mechanisms of pentoxifylline in chronic heart failure. Eur J Heart Fail 2009; 11: 113-118. 

20. Celis R, Torre-Martinez G, Torre-Amione G: Evidence for activation of immune system in heart failure: is there a role for anti-inflammatory therapy? Curr Opin Cardiol 2008; 23: 254-260. 

..............................................................................................................................................................

*ADRES DO KORESPONDENCJI:

Aleksandra Mielczarek-Palacz
Katedra i Zakład Immunologii i Serologii
Śląski Uniwersytet Medyczny
40-074 Katowice, ul. Raciborska 15
tel./ fax: 32 208 74 12
e-mail: apalacz@sum.edu.pl

Pracę nadesłano: 08.10.2010 r.
Przyjęto do druku: 16.03.2011 r.